Έπαιξε σε περισσότερες από 150 ταινίες, αλλά έγινε γνωστός διεθνώς για τις ερμηνείες του σε ρόλους σαμουράι, στις ταινίες εποχής του διάσημου συμπατριώτη του σκηνοθέτη Ακίρα Κουροσάβα.
Ο Τοσίρο Μιφούνε γεννήθηκε την Πρωταπριλιά του 1920 στην Τσίνγκταο της επαρχίας Σαντούνγκ της Κίνας, από γονείς εποίκους ιαπωνικής καταγωγής (την εποχή εκείνη η περιοχή αυτή της Κίνας βρισκόταν υπό ιαπωνική κατοχή) και χριστιανικού θρησκεύματος. Από μικρός εργαζόταν στο φωτογραφείο του πατέρα του, μαθαίνοντας την τέχνη του φωτογράφου, που αργότερα θα αποτελέσει την αφετηρία για την ενασχόλησή του με τον κινηματογράφο. Κατά τη διάρκεια του Β’ Παγκοσμίου Πολέμου υπηρέτησε σε φωτογραφικά αεροπλάνα του Ιαπωνικού Αυτοκρατορικού Στρατού.
Μετά το τέλος του πολέμου, η οικογένειά του επέστρεψε στην Ιαπωνία και ο Τοσίρο άρχισε να αναζητά εργασία μέσα στο ιδιαίτερα δύσκολο περιβάλλον της κατεστραμμένης πατρίδας του. Για καλή του τύχη, ένας φίλος του που εργαζόταν στην κινηματογραφική εταιρεία «Τόχο» τον βοήθησε να προσληφθεί ως φωτογράφος. Επωφελούμενος της απεργίας των ηθοποιών της εταιρείας δοκιμάστηκε ως ηθοποιός στο αστυνομικό δράμα «Το Ίχνος του Χιονιού»» (1947), που σκηνοθέτησε ο Σενκίτσι Τανιγκούτσι, σε σενάριο του Ακίρα Κουροσάβα.
Το επόμενο χρόνο γνώρισε τον Κουροσάβα, με τον οποίο συνεργάστηκε σε 16 ταινίες, με τις οποίες έγινε παγκοσμίως γνωστός. Το 1947 γνώρισε καλλιτεχνική και εμπορική επιτυχία στο ρόλο του γκάνγκστερ στην ταινία «Μεθυσμένος Άγγελος» του Κουροσάβα. Το 1950 έγινε διεθνώς γνωστός για το ρόλο του ληστή στην ταινία εποχής του Κουροσάβα «Ρασομόν». «Η Γκέισα κι ο Σαμουράι», όπως προβλήθηκε αρχικά στην Ελλάδα, απέσπασε το Όσκαρ καλύτερης ξένης ταινίας και βραβεύτηκε στο Κινηματογραφικό Φεστιβάλ της Βενετίας.
Η δημοτικότητα του Τοσίρο Μιφούνε εκτοξεύτηκε χάρη στις ερμηνείες του σε ρόλους σαμουράι σε άλλες ταινίες εποχής, ανάμεσά τους «Οι Εφτά Σαμουράι» (1954), «Το κρυμμένο φρούριο» (1958), «Σαντζίρο» (1962), και οι τρεις του Ακίρα Κουροσάβα, και «Εξέγερση» (1967) του Μασάκι Κομπαγιάσι.
Αναγνωρίστηκε ακόμη για τη μεγάλη γκάμα των ερμηνειών του, παίζοντας σε ταινίες του Κουροσάβα «Ο θρόνος του αίματος» (1957), ιαπωνική διασκευή του σεξπιρικού «Μάκβεθ», «Ο βυθός» (1957), διασκευή του θεατρικού έργου του Μαξίμ Γκόρκι και «Ο δολοφόνος του Τόκιο», αστυνομικό θρίλερ του 1963.
Ο Τοσίρο Μιφούνε έπαιξε και σε διεθνείς παραγωγές, όπως το «Γκραν Πρι (1966), του Τζον Φράνκενχαϊμερ, «Δύο λιοντάρια στον Ειρηνικό» (1969) του Τζον Μπούρμαν, «Τόρα! Τόρα! Τόρα!» (1969) των Ρίτσαρντ Φλάισερ, Τόσιο Μασούντα και Κίντζι Φουκασάκου, «Μονομαχία στον Κόκκινο Ήλιο» (1971) του Τέρενς Γιανγκ, «Χάρτινος τίγρης» (1975) του Κεν Άνακιν, «Η μάχη του Μίντγουεϊ» (1976) του Τζακ Σμάιτ και «1941 – Από Πού Πάνε στο Χόλιγουντ» του Στίβεν Σπίλμπεργκ.
Ακόμη, έπαιξε στην αμερικανική τηλεοπτική παραγωγή «Σογκούν, ο μεγάλος Σαμουράι» (1980), δίπλα στον Ρίτσαρντ Τσάμπερλεν, ένα σίριαλ που βασίστηκε στο ομότιτλο μπεστ σέλερ του Τζέιμς Κλάβελ, η ιστορία του οποίου τοποθετείται στην Ιαπωνία του 17ου αιώνα. Η τελευταία εμφάνισή του στη μεγάλη οθόνη καταγράφεται στην ταινία «Βαθύ Ποτάμι» (1995) του Κέι Κουμάι.
Από το 1950 έως το θάνατό της το 1995, ήταν παντρεμένος με τη Σατσίκο Γιοσιμίνε, κόρης αξιοσέβαστης οικογένειας του Τόκιο, με την οποία απέκτησε δύο αγόρια. Οι γονείς της αρχικά δεν ήθελαν τον Μιφούνε για γαμπρό τους, επειδή ήταν ηθοποιός και χριστιανός, αλλά τελικά κάμφθηκαν οι αντιρρήσεις τους με την παρέμβαση του Κουροσάβα. Από τη σχέση του με τη νεαρή ηθοποιό Μίκα Κιταγκάβα απέκτησε μία κόρη το 1982.
Ο Τοσίρο Μιφούνε απεβίωσε στις 24 Δεκεμβρίου 1997 στο Τόκιο από πολυοργανική ανεπάρκεια, σε ηλικία 77 ετών.